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Caracterización de nuevos mecanismos anti-inflamatorios de la hidroxicloroquina La desregulación del sistema inmune puede llevar a afectaciones crónicas que se conocen bajo el nombre de enfermedades inflamatorias inmuno-mediadas (EII). Las EII incluyen más de 80 entidades clínicas diferentes que llegan a afectar a cerca de 10% de la población en el mundo occidental [1]. Entre ellas se encuentran las enfermedades autoinmunes como el Lupus Eritematoso Sistémico. El estudio transversal de las EII ha permitido generalizar tratamientos exitosos que inicialmente se plantearon para entidades clínicas aisladas [1]. El co-orientador de esta Maestría (Dr Cairoli, Clínica Médica C) utiliza cotidianamente a la droga hidroxicloroquina (HCQ) para tratar pacientes con LES. La HCQ produce beneficios en el LES logrando la disminución en la actividad de la enfermedad, disminuyendo el número de secuelas de cada uno de estos episodios, logrando una significativa disminución de la morbimortalidad [2, 3]. Sin embargo, su mecanismo de acción anti-inflamatorio es parcialmente conocido [4]. Un mejor conocimiento en esta área podría redundar en una racionalización del uso de HCQ, incidiendo en la asistencia en el LES y probablemente en otras EII. Nuestra hipótesis de trabajo plantea que la HCQ sería capaz de bloquear la producción de una de las citoquinas pro-inflamatorias más potentes: IL-1beta. La proIL-1beta debe ser clivada por la caspasa 1 para generar la forma activa y secretada (IL-1beta). La caspasa 1 es a su vez activada por un complejo multiproteico llamado inflamasoma. La actividad del inflamasoma se encuentra fuertemente regulada por los niveles citoplasmáticos de K+ y Ca++ [5-7]. Canales purinérgicos activados por ATP inducen el eflujo de K+ al medio extracelular, activando la liberación de Ca++ al citosol [5-8]. El Ca++ liberado genera daño mitocondrial, activando al inflamasoma [5]. La HCQ es una droga anti-palúdica derivada de la quinina. La quinina es conocida como un potente inhibidor de canales iónicos, particularmente de K+. La HCQ es también un inhibidor de canales iónicos [9]. Sin embargo, los efectos anti-inflamatorios de la HCQ hasta el momento no han sido asociados a su capacidad de modular el metabolismo iónico. Planteamos que la HCQ, a través de su capacidad de modular el metabolismo iónico, podría ser capaz de controlar la activación del inflamasoma en células dendríticas (DCs). Para comenzar a trabajar sobre nuestra hipótesis, utilizamos DCs de ratón diferenciadas a partir de precursores de medula ósea. Tratamos las DCs con LPS y ATP ± HCQ. El tratamiento con LPS durante 4 horas (señal 1), induce la activación transcripcional de la proIL-1beta y componentes del inflamasoma. El corto pulso con ATP (45 minutos, señal 2) moviliza iones K+ y Ca++ y de esa manera se activa el inflamasoma. En nuestros ensayos, el tratamiento con HCQ se hizo de manera concomitante al ATP, con la idea de eventualmente interferir en los eventos iónicos que llevan a la activación del inflamasoma y no con la inducción de la proIL-1beta. Al cabo de 45 minutos, el sobrenadante de cultivo fué recolectado y los niveles de IL-1beta secretada (activa) fueron cuantificados por ELISA. En cuatro experimentos independientes la HCQ fué capaz de inhibir de manera dosis-dependiente la secreción de IL-1beta activa por las DCs (Figura 1). Cuantificamos el flujo de Ca++ en DCs tratadas con LPS-ATP utilizando el mismo protocolo de estimulación, y mediante la utilización de sondas fluorescentes sensibles al Ca++. De manera totalmente inesperada se vió que el flujo de ese ion a nivel citoplasmático era mayor en presencia de HCQ con respecto al control (LPS-ATP sin HCQ) en una cinética prolongada (Figura 2). Objetivo general Determinar si la HCQ es capaz de regular la activación del inflamasoma en DCs. Buscaremos además definir los mecanismos moleculares responsables de ese efecto. Objetivos específicos y plan de trabajo: 1) Caracterizar si la HCQ modula el procesamiento post-traduccional de la proIL-1beta a través de la caspasa 1. Analizaremos por western blot el sobrenadante de cultivo y lisados celulares de DCs tratadas con LPS/ATP±HCQ utilizando anticuerpos anti-IL-1beta y anti-caspasa 1. Estos estudios nos permitirán determinar si la disminución observada en los niveles de IL-1beta luego del tratamiento con HCQ se da a expensas de una disminución del procesamiento post-traduccional de la proIL-1beta a través del inflamasoma. 2) Analizar si la HCQ es capaz de inhibir la producción de IL-1beta por DCs humanas. Utilizaremos DC derivadas de monocitos de sangre periférica de donantes sanos [10]. Cuantificaremos la producción de IL-1beta por ELISA y western blot en el sobrenadante de cultivo luego del tratamiento LPS/ATP±HCQ. 3) Caracterizar mecanismos moleculares implicados en el control del inflamasoma por la HCQ. La mitocondria actúa down-stream la liberación de Ca++ para activar al inflamasoma. Nuestros resultados muestran que el tratamiento con HCQ disminuye la IL-1beta pero inesperadamente aumenta la liberación de Ca++. Esto sugiere que la HCQ podría hacer que la mitocondria sea refractaria al Ca++. Si la HCQ interfiere con el impacto del Ca++ en la mitocondria luego del tratamiento con ATP, entonces podrían co-existir niveles elevados de Ca++ citosólico con niveles disminuidos de IL-1beta. Apoyando nuestra interpretación, ha sido reportado que la cloroquina inhibe la activación Ca++-dependiente de la fosfolipasa D mitocondrial [11]. Como un primer encare estudiaremos por FACS la producción de radicales libres y el potencial de membrana mitocondriales utilizando las sondas MitoSox y MitoTracker Green/Red respectivamente en DCs tratadas con LPS/ATP±HCQ [5]. Si observamos que la HCQ no afecta estos parámetros mitocondriales analizaremos otros mecanismos asociados a la activación de inflamasomas como el eflujo de iones K+ (FACS con sondas específicas; medios ricos en K+); inestabilidad lisosomal (sondas fluorescentes lisotrópicas analizadas por microscopia confocal) o producción de radicales libres totales (DCHF por FACS). 4) Determinar si la HCQ es capaz de inhibir el inflamasoma in vivo. La sepsis por punción intestinal es uno de los modelos validados para estudiar la activación del inflamasoma [12, 13]. El equipo del Prof. Dr. Noboa (Clínica Nefrológica) ha utilizado este modelo en el trabajo de Maestría de las Dras Seija y Baccino. Colaboraremos con ellos para tratar animales sépticos con HCQ. Analizaremos la IL-1beta en suero (ELISA), la función renal y la sobrevida. 1. Baeten, D. Memorandum of understanding for the implementation of a European Concerted Research Action designates as COST Action BM0907: European Network for Translational Immunology Research and Education (ENTIRE): From Immunomonitoring to personalized immunotherapy. . 2009. 2. Shinjo, S., et al., Antimalarial treatment may have a time-dependent effect on lupus survival: data from a multinational Latin American inception cohort. Arthritis Rheum, 2010. 62(3): p. 855-62. 3. Cairoli, E., et al., Hydroxychloroquine reduces low-density lipoprotein cholesterol levels in systemic lupus erythematosus: a longitudinal evaluation of the lipid-lowering effect. Lupus, 2012. 21(11): p. 1178-82. 4. Lee, S.-J., E. Silverman, and J. Bargman, The role of antimalarial agents in the treatment of SLE and lupus nephritis. . Nat Rev Nephrol. , 2011. 7: p. 718-729. 5. Murakami, T., et al., Critical role for calcium mobilization in activation of the NLRP3 inflammasome. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012. 109(28): p. 11282-7. 6. Compan, V., et al., Cell volume regulation modulates NLRP3 inflammasome activation. Immunity, 2012. 37(3): p. 487-500. 7. Mariathasan, S., et al., Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature, 2006. 440(7081): p. 228-32. 8. Lee, G.S., et al., The calcium-sensing receptor regulates the NLRP3 inflammasome through Ca2+ and cAMP. Nature, 2012. 492(7427): p. 123-7. 9. Ponce-Balbuena, D., et al., Molecular mechanisms of chloroquine inhibition of heterologously expressed Kir6.2/SUR2A. Mol Pharmacol, 2012. Jul 31: p. Epub ahead of print. 10. Hill, M., et al., IDO expands human CD4+CD25high regulatory T cells by promoting maturation of LPS-treated dendritic cells. Eur J Immunol, 2007. 37(11): p. 3054-62. 11. Madesh, M. and K. 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