ANII | Agencia Nacional de Investigación e Innovación

La tecnología recombinante ha posibilitado la producción de un amplio repertorio de proteínas de interés con aplicaciones tan variadas como la reproducción, los suplementos alimenticios y la medicina. Sin embargo, los altos costos asociados al proceso de producción y purificación de las proteínas recombinantes impiden su uso en el campo veterinario. Para superar estas limitaciones es necesario desarrollar estrategias de producción y purificación alternativas de bajo costo. Nuestro grupo ha sido pionero en la región en el uso del protozoario no patógeno Leishmania tarentolae como sistema económico de expresión de proteínas heterólogas, el cual además presenta perfiles de glicosilación similares a los de eucariotas superiores. Utilizando este sistema hemos obtenido una glicoproteína de interés veterinario con actividad biológica, a altos niveles y bajo costo comparado a los sistemas de expresión de células de mamífero. En este proyecto proponemos desarrollar herramientas que permitan reducir drásticamente los costos asociados al proceso de purificación, comúnmente basado en cromatografías. Con este propósito planteamos explotar la propiedad de auto-escisión de los polipéptidos llamados inteínas y de ?tags? de purificación no convencionales como el polipéptido ?Elastin-like? para la generación de una nueva serie de vectores de expresión en L. tarentolae. A su vez, con el fin de monitorear in vivo e in vitro el proceso de auto-escisión, diseñamos diferentes construcciones incorporando variantes espectrales de la proteína verde fluorescente que sean capaces de reportar la escisión catalizada por la inteína. Este novedoso sistema es ideal en aplicaciones ?high throughput? tendientes a optimizar condiciones de expresión y purificación de proteínas de interés, minimizando las pérdidas de rendimiento por escisión no controlada de la inteína. Estas herramientas serán de utilidad general en biología molecular, el área farmacéutica y otras aplicaciones que demanden altos niveles de pureza con una relación satisfactoria de costo-beneficio.

La tecnología recombinante ha posibilitado la producción de un amplio repertorio de proteínas de interés con aplicaciones tan variadas como la reproducción, los suplementos alimenticios y la medicina. Sin embargo, los altos costos asociados al proceso de producción y purificación de las proteínas recombinantes impiden su uso en el campo veterinario. Para superar estas limitaciones es necesario desarrollar estrategias de producción y purificación alternativas de bajo costo. Nuestro grupo ha sido pionero en la región en el uso del protozoario no patógeno Leishmania tarentolae como sistema económico de producción de este tipo de proteínas. Utilizando este sistema hemos obtenido una proteína compleja de interés veterinario con actividad biológica, a altos niveles y bajo costo comparado a los sistemas de expresión de células de mamífero que son los utilizados habitualmente. En este proyecto evaluamos alternativas que permitan reducir drásticamente los costos asociados al proceso de purificación. Exploramos la utilización de un polipéptido tipo elastina (ELP), que se incorpora a la proteína de interés para lograr purificarla de forma rápida y económica, y otra molécula llamada inteina que permite remover el ELP del producto final. Los resultados mostraron que L. tarentolae es capaz de producir proteínas unidas a ELP y que es posible purificarlas tan solo aumentado la temperatura y concentración de sales del medio. La inteina DeltaCM que utilizamos realiza el corte del ELP de forma prematura dentro de la célula, por lo que no puede utilizarse en este sistema de producción. En este momento estamos probando inteínas alternativas. Estos resultados son el primer reporte de utilización de ELP e inteinas en la producción de proteínas en L. tarentolae y abre un campo muy interesante para continuar desarrollando herramientas para la comunidad científica y empresas con perfil biotecnológico.